Anti - herpes 82

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Anti-herpes simplex virus attività di monogalactosyl digliceridi e digalactosyl digliceridi da nutans Clinacanthus. una medicina tradizionale tailandese a base di erbe Sirada Pongmuangmul 1,2 Supaporn Phumiamorn 3 Phanchana Sanguansermsri 1 Nalin Wongkattiya 4 Ian Hamilton Fraser 5 Donruedee Sanguansermsri 1,6 ,. 1 Facoltà di Medicina, Naresuan University, Phitsanulok 65000, Thailandia 2 scienze mediche regionali Centro Nakhonswan, Dipartimento di Scienze Mediche, Ministero della Salute, Nakhonswan 60130, Thailandia 3 Istituto di prodotti biologici, Dipartimento di Scienze Mediche, Ministero della Salute, Nonthaburi 11000 , Thailandia 4 Facoltà di Scienze, Maejo Università, Chiang Mai 50290, Thailandia 5 Facoltà di Chimica, Monash University, Victoria 3800, Australia 6 Centro di eccellenza in Biotecnologie mediche, Facoltà di medicina, Naresuan University, Phitsanulok 65000, Thailandia ricevuti 19 novembre 2015. Rivisto 1 ° dicembre 2015. accettato 8 dicembre 2015. Disponibile online il 6 gennaio 2016. Estratto Obiettivo per valutare l'digliceridi monogalactosyl (MGDG) e digalactosyl digliceridi (DGDG) da nutans Clinacanthus (C. nutans) per le loro attività antivirale in vitro contro l'herpes virus di tipo simplex 1 (HSV-1) e di tipo 2 (HSV-2) mediante saggio di riduzione delle placche. Metodi MGDG e DGDG sono stati estratti con cloroformio da C. nutans foglie. MGDG e DGDG sono stati separati dal cloroformio estratto grezzo mediante cromatografia su colonna, caratterizzato cromatografia su strato sottile e quantificati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni. L'anti HSV-1 e 2 attività contro pre-trattamento e post-trattamento dei composti è stata valutata mediante saggio di riduzione delle placche. La citotossicità dell'estratto ei composti su cellule Vero sono state eseguite mediante saggio MTT. Risultati MGDG e DGDG ottenuti mediante cromatografia in colonna mostrato profili identici come standard MGDG e DGDG norma utilizzando cromatografia su strato sottile e la cromatografia liquida ad alte prestazioni. MGDG e DGDG da C. nutans hanno mostrato 100 inibizione della HSV-1 replica alla fase di post di infezione a una concentrazione non citotossica con IC 50 valori di 36.00 e 40.00 g / mL, e HSV-2, rispettivamente a 41,00 e 43,20 g / mL,. Inoltre, MGDG e DGDG da C. nutans stati dimostrato di avere attività anti-simplex herpes allo stesso livello come composti sintetici standard. Al contrario, il pre-trattamento di cellule Vero con MGDG e DGDG prima infezione da HSV-1 e HSV-2 non ha mostrato effetto inibitorio contro questi virus. MGDG e DGDG esposti attività antivirale contro l'HSV-1 con indice di selettività di 26.00 e 23.00 e HSV-2 di 23.30 e 21.30. Conclusioni MGDG e dgdg da C. nutans. una medicina di erbe tradizionale tailandese illustrato attività inibitoria nei confronti di HSV-1 e HSV-2, probabilmente inibendo la fase tardiva della moltiplicazione, suggerendo il loro uso promettenti come agenti anti-HSV. Parole Glycoglycerolipids Monogalactosyl digliceridi Digalactosyl digliceridi Clinacanthus nutans Herpes simplex virus di tipo 1 Herpes virus di tipo simplex 2 Attività antivirale 1 Introduzione Herpes virus di tipo simplex 1 infezioni (HSV-1) e tipo 2 (HSV-2) sono distribuiti in tutto il mondo negli esseri umani con diverso grado di gravità. Si può portare a situazioni pericolose per la vita, in particolare nei pazienti immunocompromessi. HSV-1 è più frequentemente associata a lesioni mucocutanee orofacial. HSV-2 è più comunemente associato con l'herpes genitale. Herpes virus possono causare primaria, e infezioni ricorrenti su riattivazione virale attraverso stimoli come la luce solare, stress e l'immunità indebolita 1 e 2. Il farmaco di scelta della profilassi e il trattamento di infezione da HSV è aciclovir, un analogo nucleosidico, che inibisce selettivamente la replica HSV con tossicità cellulare bassa ospite 3 e 4. farmaci antivirali Tuttavia, la comparsa di virus resistenti ai utilizzata comunemente è un problema per il trattamento, in particolare nei pazienti e neonati 5. 6 e 7. di conseguenza immunocompromessi, vi è la necessità di cercare nuovi e agenti antivirali più efficaci che possono sostituire o integrare attualmente utilizzati farmaci antivirali 8. Le piante medicinali sono noti per essere una fonte di abbondante di composti chimici e tradizionalmente utilizzati nel settore sanitario in molti paesi. Un gran numero di piante, sia come estratti o composti puri, hanno dimostrato di esibire attività antivirale 9. 10 e 11. Clinacanthus nutans (Burm. F.) Lindau (C. nutans) è una pianta medicinale in famiglia Acanthaceae che è nativo di molti paesi tropicali dell'Asia, tra cui Thailandia e spesso coltivati. C. nutans è stato tradizionalmente usato come una medicina per il trattamento topico di eruzioni cutanee, insetti e serpenti morso, HSV, e varicella-zoster virus lesioni 12 e 13. Gli studi clinici hanno riportato alla corretta applicazione di C. nutans trattamento topico per il sollievo di infiammazione della pelle e punture di insetti, herpes genitale e lesioni della varicella-zoster 14. greggio estratto di C. nutans foglie ha dimostrato di inibire la HSV-1 e HSV-2 attività 15. Nel indagini fitochimiche, flavonoidi, steroidi, triterpenoidi, cerebrosidi, due glycoglycerolipids , gliceridi, gliceridi contenenti zolfo sono stati isolati da questa pianta 16 e 17. Trigalactosyl e digalactosyl digliceridi isolati da C. nutans hanno dimostrato di esibire attività antivirale 18. glycoglycerolipids sintetici ha anche dimostrato di inibire HSV 19. In questo studio, l'inibizione di HSV-1 e HSV-2 da due glycoglycerolipids: monogalactosyl digliceridi (MGDG) e digalactosyl digliceridi (DGDG), isolato da C. nutans ed estratto di cloroformio greggio di C. nutans foglie sono stati studiati mediante saggio di riduzione della placca . Inoltre, la modalità delle attività inibitoria è stata anche determinata aggiungendo il composto nella diversa fase di replicazione del virus. 2 Materiali e metodi materiale 2.1 delle piante e l'estrazione C. nutans piante sono stati raccolti da Uthai Thani, Thailandia da Warayu Leeprasert, Thai esperto di piante medicinali. Le foglie secche sono state estratte con cloroformio utilizzando un'apparecchiatura di estrazione Soxhlet a 60 C per 8 h. estratti intere sono state raccolte e il solvente evaporato a secchezza con un evaporatore rotante. Gli estratti grezzi sono stati conservati a 20 ° C fino all'uso in test. 2.2 Preparazione di MGDG e DGDG Gli estratti grezzi sono stati parzialmente purificato su colonna di gel di silice 60 per eluizione esaustiva con 350 mL di ciascuna delle seguenti fasi di eluizione: cloroformio: acetone (9: 1, 3: 1 e 1: 1), acetone puro e acetone: metanolo (3: 1) 20. e 50 ml di ogni frazione è stato raccolto ed evaporati per ulteriore identificazione di MGDG e DGDG. Ogni frazione è stata verificata per MGDG e DGDG per cromatografia su strato sottile (TLC) e confrontato con lo standard MGDG e DGDG (Larodan AB, Svezia). La fase di identificazione MGDG consisteva di cloroformio: acetone: acqua distillata (30: 60: 2). Fase mobile per l'identificazione DGDG consisteva di cloroformio: acetone: metanolo: acido acetico glaciale: acqua distillata (100: 40: 20: 30: 10) 21. Le frazioni che contenevano MGDG o DGDG sono riunite ed evaporate con evaporatore rotante. Conferma di MGDG è stata effettuata utilizzando TLC con 2 sistemi di fase mobile, cloroformio: acetone: acqua distillata (30: 60: 2) e acetone: acido acetico glaciale: acqua distillata (100: 2: 1) è stata eseguita 22. Conferma di DGDG usando TLC con 2 sistemi di fase mobile, cloroformio: metanolo: acido acetico glaciale: acqua distillata (85,0: 15,0: 10,0: 3,5) 22 e cloroformio: acetone: metanolo: acido acetico glaciale: acqua distillata (100: 40: 20: 30 : 10) 21. La quantità di MGDG e DGDG è stato osservato e determinato da elevate prestazioni cromatografia liquida (HPLC) utilizzando un Agilent 1100 dotato di rivelatore a serie di diodi foto a 254 nm. MGDG e DGDG sono stati separati a 30 C con una colonna di silice, dimensioni 200,0 millimetri 4,6 millimetri, particella 5 m (Hypersil silice). La portata era di 1 ml / min e la fase mobile era esano: isopropanolo (97,5: 2,5) 23. 2.3 Virus e linee cellulari cellule Vero (cellule renali di scimmia verde africana) sono state coltivate in monostrato in coltura con Dulbeccos modificato media Aquila, integrato con 5 siero fetale bovino. HSV-1 e HSV-2 sono stati forniti dal Dr. Panadda Dhepakson, Biotecnologie mediche Center, Dipartimento di Medicina, Thailandia. le riserve di virus sono stati preparati da colture infette in cellule Vero con terreno di mantenimento (Dulbeccos modificato media Aquila, 2 siero fetale bovino e 1 antibiotico), propagati a 37 C, 5 CO 2 e virus titolo è stato determinato mediante saggio di placca su cellule Vero. 2.4 citotossicità test di citotossicità è stata valutata mediante il test MTT. Un volume di 100 L di cellule Vero a una concentrazione 2,5 10 5 cellule / ml sono state seminate in piastra a 96 pozzetti e propagato a 37 ° C con 5 CO 2 per 1 giorno. Il mezzo coltura è stato sostituito con terreno di mantenimento fresco contenente diverse concentrazioni di estratto di cloroformio greggio, estratto e purificato MGDG e DGDG. Le cellule sono state incubate a 37 C con 5 CO 2 per 2 giorni, e il reagente MTT (20 L) è stato aggiunto a ciascun pozzetto. Dopo 4 h di ulteriore incubazione, la formazan stato solubilizzato aggiungendo HCl diluito (0,04 mol / L) in isopropanolo, e l'assorbanza è stata determinata a 490 nm lettore di piastre ELISA Biotek con lunghezza d'onda di riferimento di 620 nm. La concentrazione 50 citotossica (CC 50) causando cambiamenti morfologici visibili in 50 delle cellule Vero sono stati determinati 24. 2.5 saggio di attività antivirale L'attività antivirale di glycoglycerolipid da Phaya imbardata stata valutata mediante saggio di riduzione delle placche come precedentemente descritto sono stati aggiunti 25. I composti nella fase diversa durante il ciclo di infezione virale per rintracciare la modalità di azione antivirale. 2.6 pre-trattamento il monostrato cellulare Vero è stato pretrattato con estratto di cloroformio greggio, MGDG, DGDG, standard di MGDG, di serie DGDG e acyclovir a 37 ° C per 24 ore prima di infezione da virus. Dopo il lavaggio, le cellule sono state infettate con HSV-1 oppure HSV-2 ad una molteplicità di infezione di 0,1 a 37 C per 1 h. Le cellule infette sono state lavate, e sovrapposti con 3 mL di 1,2 nutrienti metilcellulosa e incubate a 37 C per 48 e 96 h per HSV-1 e HSV-2, rispettivamente. Le cellule infettate sono state fissate con 5 formaldeide, colorate con cristalvioletto 0,5 e quindi il numero di placche è stato contato. La percentuale di concentrazione di attività inibitoria è stata determinata e IC 50 è stata determinata dalla curva relativa alla percentuale di concentrazione di attività inibitoria alla concentrazione dei campioni. 2.7 post-trattamento cellule confluenti Vero sono state infettate con 100 placche unità formatrice di HSV-1 oppure HSV-2. Dopo adsorbimento a 37 C per 1 h, le cellule infette sono state lavate e sovrapposti con 3 mL di 1,2 nutrienti metilcellulosa contenente cloroformio estratto grezzo, MGDG, DGDG standard MGDG standard DGDG e acyclovir in varie concentrazioni e incubate a 37 C per 48 e 96 h per HSV-1 e HSV-2, rispettivamente. Le cellule sono state poi trattate come descritto in precedenza per il saggio di riduzione numero di placche virali. 3 Risultati 3.1 Isolamento e caratterizzazione di estratto grezzo e MGDG e DGDG da C. nutans estratto grezzo di C. nutans foglie secche stato ottenuto dopo estrazione con cloroformio con resa del 7. L'estratto grezzo è stato quindi eseguito attraverso una colonna di gel di silice e sequenzialmente eluite con 5 diversi eluenti. Le frazioni di 50 ml sono stati raccolti secondo il metodo descritto da Diehl et al. 20. Dopo aver eseguito il greggio estratto, MGDG è stato eluito da frazioni 1215 e DGDG è stato eluito da frazioni 2628. Le porzioni pool di ogni frazione di MGDG e DGDG sono stati identificati dalla preliminare TLC (Figura 1) quando si utilizzano diversi sistemi di fase mobile. Il MGDG da C. nutans mostrato simile R f come standard MGDG (figura 1 a, b), così come i DGDG da C. nutans e lo standard DGDG (Figura 1 c, d). L'identificazione di MGDG e DGDG estratti sono stati confermati mediante HPLC. profili HPLC ottenuti MGDG e DGDG estratti sono stati confrontati bene a quella standard MGDG e DGDG (Figura 2). Figura 1. TLC cromatogramma MGDG estratto e purificato da C. nutans e standard di MGDG in cloroformio: acetone: acqua (a) e in acetone: acido acetico glaciale: acqua (b), estratto e purificato da DGDG C. nutans e lo standard DGDG in cloroformio: acetone: acqua (c) e acetone: acido acetico glaciale: acqua (d). Figura 2. HPLC cromatogramma. A: estratto e purificato MGDG da C. nutans B: Standard MGDG C: estratto e purificato DGDG da C. nutans D: Standard DGDG. 3.2 citotossicità Per esaminare i possibili effetti citotossici di estratto di cloroformio, estratto e purificato MGDG e DGDG da C. nutans sulla vitalità delle cellule, cellule Vero sono state incubate con diverse concentrazioni (10015 000 g / ml) dei composti per 48 ore e vitalità cellulare era determinato tramite test MTT. Come mostrato in Figura 3. estratto e purificato MGDG e DGDG da C. nutans mostrato un minor effetto tossico del cloroformio estratto grezzo. In Tabella 1. sono stati segnalati il ​​CC 50 per questi composti. In questo studio, cloroformio, estratto e purificato MGDG e DGDG da C. nutans sono stati studiati per l'efficacia contro HSV-1 e HSV-2 infettate cellule Vero. In cellule Vero, CC 50 di estratto di cloroformio, estratto e purificato MGDG e DGDG da C. nutans era tra 520 e 960 g / mL. Attività di estratto e purificato MGDG e DGDG da C. nutans era meno tossico del estratto grezzo cloroformio. Figura 3. Determinazione della CC 50 di estratto di cloroformio greggio, estratto e purificato MGDG e DGDG da C. nutans su cellule Vero. Tabella 1. Citotossicità, anti-HSV attività sul post-trattamento, e l'indice di selettività di cloroformio estratto grezzo, estratto e purificato MGDG e DGDG da C. nutans. standard di MGDG, DGDG standard ed aciclovir. ND: Nessun rilevamento. 3.3 Anti HSV-1 e 2 attività L'effetto di cloroformio, MGDG e DGDG da C. nutans su HSV è stato valutato per l'inibizione a differenti fasi dell'infezione. cellule Vero sono stati pre-trattati con estratto di cloroformio greggio, estratto e purificato MGDG, estratto e purificato DGDG standard MGDG e lo standard DGDG in diverse concentrazioni a livelli subtoxic. In fase di post-trattamento, i composti sono stati aggiunti alle cellule dopo l'infezione virale. Acyclovir è stato utilizzato anche come controllo farmaco in studio anti-HSV. Alle concentrazioni massime non citotossiche di tutti i composti, gli anti HSV-1 e HSV-2 attività con post-trattamento mostravano 100 inibizione della formazione di placche che pre-trattamento ha meno di 50 inibizione della formazione di placche (Figura 4). Il risultato ha indicato che l'estratto di cloroformio estratto e purificato MGDG e DGDG da C. nutans. standard di MGDG e lo standard DGDG prevalentemente influenzati anti-HSV-1 attività di infezioni post virale con IC50 valore 115.00, 36.00, 40.00, 31.00 e 33.60 g / mL, rispettivamente e anti HSV-2 attività con IC50 valore di 140.00, 41.00, 43.20, 33.40 e 36.80 g / ml, rispettivamente. Inoltre, acyclovir espresso il valore IC 50 sul post-trattamento a 0,64 e 0,80 g / mL per HSV-1 e HSV-2 (Tabella 1). In particolare, estratto e purificato MGDG e DGDG da C. nutans mostrato attività antivirale con indici di selettività (CC 50 / IC 50) su HSV-1 di 26.0 e 23.1 e HSV-2 di 23,3 e 21,3 rispettivamente (Tabella 2). Figura 4. Mezzo di attività inibitoria di estratto di cloroformio greggio, estratto e purificato MGDG e DGDG da C. nutans contro HSV-1 (A) e HSV-2 (B) durante le diverse fasi di infezione virale. I virus sono stati trattati con la concentrazione subtoxic massima dei composti. Acyclovir è stato utilizzato come controllo in ciascun esperimento. Dati rappresentata la percentuale di inibizione del virus rispetto ai controlli non trattati come media ± DS. Tabella 2. indice di selettività di estratto grezzo, estratto e purificato MGDG e DGDG da C. nutans sulla replicazione di HSV-1 e HSV-2 post-trattamento. indice di selettività (CC 50 / IC 50) cloroformio estratto grezzo MGDG da C. nutans DGDG da C. nutans 4 di discussione per molte generazioni, le piante medicinali sono state utilizzate dalle popolazioni indigene per il trattamento di molte malattie infettive, tra cui l'infezione da HSV. La medicina moderna utilizza attualmente acyclovir e altri derivati ​​nucleosidici sono stati utilizzati nel trattamento delle infezioni da HSV. Tuttavia, questi sono costosi e un gran numero di persone, soprattutto provenienti dai paesi in via di sviluppo, potrebbe non essere in grado di permettersi i farmaci costosi. Pertanto, alcune piante medicinali che possono essere trovati localmente sarebbe un trattamento alternativo. In questo studio, l'attività antivirale di cloroformio estratto grezzo, estratto e purificato MGDG e DGDG da C. nutans sono stati studiati per la loro attività antivirale contro HSV-1 e HSV-2 su cellule Vero. test di citotossicità è una parte importante per la valutazione di un potenziale agente antivirale perché un estratto o composti dovrebbero essere selettivi per i processi virali specifici con poco o nessun effetto sul metabolismo cellulare ospitante. Pretrattamento di cellule Vero con estratto di cloroformio, estratto e purificato MGDG e DGDG per 24 h prima dell'infezione virale dimostrato che questi campioni presentavano 50 effetto protettivo contro il processo di infezione da HSV-1 e HSV-2. Al contrario, i risultati hanno dimostrato che estratto e purificato MGDG e DGDG da C. nutans dimostrato 100 inibizione della HSV-1 e HSV-2 replica alla fase di post-infezione a concentrazioni subtoxic. Inoltre, estratto e purificato MGDG e DGDG da C. nutans mostra attività anti-HSV allo stesso livello dei campioni standard MGDG e DGDG. I composti estratti e purificati visualizzati moderata attività anti HSV-1 e HSV-2 con valori di IC 50 vanno da 36.00 al 43.20 g / mL. Inoltre, l'estratto di cloroformio greggio di C. nutans ha mostrato meno efficaci contro HSV-1 e HSV-2 rispetto al estratto e purificato MGDG e DGDG. Essa può postulare che MGDG e DGDG sono uno dei principali contribuenti verso l'inibizione della replicazione del virus herpes. Gli spettacoli indice di selettività che estratto e purificato MGDG e DGDG da C. nutans sono selettivi per l'inibizione di infezione da HSV-1 e HSV-2. Simile al aciclovir, estratto e purificato MGDG e DGDG inibiscono HSV-1 e HSV-2 replica. Acyclovir inibisce specificatamente la DNA polimerasi virale durante il ciclo di replica quando nuovo DNA virale è sintetizzato 26. Da questo studio, si potrebbe dire che le attività inibitoria contro HSV-1 e HSV-2 di estratto e purificato MGDG e DGDG da C. nutans sono i più efficaci nella fase di post dell'infezione. Anche se il meccanismo di attività anti-HSV di MGDG e DGDG non è ancora chiaro, un rapporto ha mostrato che alcuni monogliceridi hanno mostrato attività antivirale contro virus con involucro dalla distruzione di Pericapside 27. Studio dei digliceridi monoglycosyl sintetici ha anche mostrato attività inibitoria nei confronti di HSV-1 e HSV-2 in cellule Vero 19. Ciò è in accordo con il precedente studio che ha segnalato l'effetto inibitorio di C. nutans estratto contro HSV-1 e HSV-2 infezione prima ingresso del virus alle cellule ospiti 15. Il costituente attivo da C. nutans. clorofilla a e b clorofilla. sono stati anche trovati ad avere anti-HSV attività prima l'ingresso del virus punto 16. Altri ricercatori hanno riportato anche attività anti-HSV di esano, diclorometano e metanolo estratti da C. nutans alla fase di post di infezione 15. E 'interessante notare che questo differisce di uno studio in cui l'acqua e solventi organici estratti di C. nutans non ha inibito la replicazione di HSV in cellule Vero 28 e 29. In conclusione, questo studio ha scoperto l'attività inibitoria di estratto e purificato MGDG e DGDG da C. nutans contro HSV-1 e HSV-2 probabilmente nel passaggio di post ingresso del virus. C. nutans è un farmaco a base di erbe Thai utilizzato per infezione da herpes per molte generazioni e l'erba è generosamente a disposizione tutto il Sud Est asiatico. MGDG e DGDG da C. nutans hanno dimostrato di avere attività anti-simplex herpes allo stesso livello come composti sintetici disponibili in commercio. Conflitto di interesse che dichiarano che non abbiamo alcun conflitto di interessi. Ringraziamenti Vorremmo ringraziare il Dipartimento di Scienze Mediche, Ministero della sanità pubblica, in Thailandia per il loro sostegno finanziario (Grant No. RMSC-3NK-RD-27-2011). Riferimenti 1 C. Johnston. L. Corey concetti attuali per l'infezione da virus herpes simplex genitale: la diagnostica e la patogenesi di malattie del tratto genitale spargimento Clin Microbiol Rev. Volume 29. Problema 1. 2016. pp 149.161 2 S. M.. Ghirlanda. M. Steben Herpes genitale migliore Pract Res Clin Obstet Gynaecol. . Volume 28. Problema 7. 2014. pp 10.981.110 3 canadese Agenzia delle droghe e delle tecnologie a risposta rapida Salute CADTH riporta Aciclovir contro valaciclovir per il virus herpes nei bambini e donne in gravidanza: una revisione della evidenza clinica e le linee guida. 2014. Agenzia Canadese delle droghe e delle tecnologie in sanità, Ottawa 4 S. Sawleshwarkar. D. E. 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